Die Analysemethoden der Cannabispflanze

Einleitung

Die chemische Zusammensetzung von Cannabis bestimmt dessen positive und negative Auswirkungen auf den menschlichen Körper. Verschiedene Stämme der Cannabispflanze, unterscheiden sich in ihrem Wirkstoffverhältnis. Da Cannabis eine Pflanze und keine chemisch gewonnene Substanz ist, ist es noch immer eine Herausforderung, alle pflanzlichen Verbindungen zu analysieren und dementsprechende Kontrollwerte aufzustellen.[1]

Der Bedarf an qualitätsanalytischen Tests wächst ständig – besonders da immer mehr Staaten und Gebiete Cannabis für medizinische Zwecke oder für den Freizeitgebrauch legalisieren. Während der gesamten Lieferkette vom Hersteller bis zum Extraktor und Verarbeiter können Tests viele Vorteile bringen.[2]

Quantitative Methoden

Es gibt viele Methoden, mit denen die Wirkung von Cannabinoiden quantifiziert werden kann. Die Cannabinoidextraktionsmethoden variieren je nach Versuchsbedarf. Generell werden Cannabinoide hierbei in einem Lösungsmittel gelöst. Das am häufigsten verwendete Lösungsmittel für Cannabinoide ist Methanol/Chloroform im Verhältnis 9:1 (% v/v).[3] Nach der Extraktion werden die Cannabinoide mit verschiedenen Methoden qualitativ analysiert.

Qualitative Methoden

Die Ultrahochdruck-Flüssigkeitschromatographie (UHPLC) kann in Kombination mit der Tandem-Massenspektrometrie die Cannabinoidspiegel im Urin von Personen analysieren, die hohen Cannabinoid-Dosen ausgesetzt sind.[4]

Andere qualitative Methoden zur Analyse von Cannabinoiden umfassen die Flüssigkeits- oder Gaschromatographie (LC oder GC) in Kombination mit Quadrupol-Massenspektrometrie (MS) oder Tandem-Massenspektrometrie.[5]

Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)

Methode

Die Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) ist eine der effektivsten und weit verbreitetsten Methoden zur Trennung komplexer Stoffgemische,.[6] Als Analysemethode gehört die HPLC zu einer Gruppe von Methoden, die aufgrund der Komplexität der untersuchten Objekte die vorläufige Trennung der anfänglichen komplexen Mischung in relativ einfache Bestandteile ermöglicht. Die resultierenden einfachen Gemische werden dann mit herkömmlichen physikalisch-chemischen Methoden oder mit speziellen für die Chromatographie entwickelten Methoden analysiert.[7]

Das Prinzip der Flüssigkeitschromatographie besteht darin, die Komponenten eines Gemisches anhand des Unterschieds in ihrer Gleichgewichtsverteilung zwischen zwei nicht mischbaren Phasen zu trennen, von denen eine stationär und die andere beweglich (Elutionsmittel) ist.[8] Ein charakteristisches Merkmal der HPLC ist die Verwendung von Hochdruck (bis zu 400 bar) und feinkörnigen Sorptionsmitteln (normalerweise 3 bis 5 Mikrometer, jetzt bis zu 1,8 Mikrometer). Dies ermöglicht die schnelle und vollständige Trennung komplexer Stoffgemische (durchschnittliche Analysezeit von 3 bis 30 Minuten).[9]

Kieselgel ist heutzutage allgemein anerkannt und wird häufig als stationäre Phase (Sorptionsmittel) verwendet.

Protokolle

500 mg trockene homogenisierte Cannabispflanzenmasse werden in 5 ml einer Mischung aus Methanol:Chloroform (in einem Volumenverhältnis von 9:1) in der folgenden Reihenfolge extrahiert: 10 Sekunden in einem Wirbelschüttler, danach 15 Minuten in einem Ultraschallbad Dieser Vorgang kann wiederholt werden. Anschliessend wird die Mischung zentrifugiert.[10]

200 µl des so entstandenen Extrakts werden in ein Derivatisierungsgefäss gegeben. Das Lösungsmittel wird vollständig mit Stickstoffgas verdampft. Die Probe wird 15 Minuten bei einer Temperatur von 210°C decarboxyliert. Der Rückstand wird in 200 µl Menthanol: Chloroform (9:1 v/v) gelöst.[11]

Die durch Decarboxylierung erhaltene Lösung wird 100-fach mit Methanol verdünnt (in zwei Stufen, in denen jeweils 900 µl Methanol zu 100 µl des Analyten gegeben werden) und anschliessend analysiert. Bei Proben mit einem niedrigeren TCG-Gehalt (<0,5 Prozent) reicht es aus, die Lösung nicht 100, sondern 10-mal zu verdünnen. Standardlösungen können bis zu vier Monate an einem kühlen, dunklen Ort gelagert werden.[12]

Qualität

Dieses Verfahren ermöglicht die Trennung verschiedener Gemische von Molekülen (einschliesslich Gemischen aller Arten von Isomeren); synthetischer Makromoleküle und Biopolymere (einschliesslich Viren und Moleküle mit Massen von bis zu mehreren Millionen amu); Ionen und stabiler Radikale.[13]

Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC)

Methode

Das nachstehend beschriebene Verfahren der Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC) ist ein validiertes Verfahren zur Analyse von Gesamt-THC (THC + THCOOH) in Cannabispflanzenmaterial nach Extraktion mit Methanol/Chloroform und anschliessender Debocarboxylierung. Nach ordnungsgemässer Überprüfung kann HPTLC auch zur Analyse anderer Cannabisprodukte verwendet werden.

Als weiterentwickelte Form der Dünnschichtchromatographie (DC) wird bei HPTLC die Trennung von Substanzen in Hochleistungs-Dünnschichten unter Verwendung automatisierter Geräte durchgeführt, wodurch eine verbesserte Trennleistung erzielt wird.[14] In Bezug auf Trennleistung und Reproduzierbarkeit ist das Verfahren der Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie anderen Verfahren der planaren Chromatographie – Papier- und Dünnschichtchromatographie – überlegen.

Für zusätzliche Untersuchungen von Substanzen ist es möglich, sie mit anderen physikochemischen Methoden zu kombinieren, beispielsweise mit Massenspektrometrie via direkter Extraktion einer Zone einer Substanz aus einem Sorptionsmittel und deren Übertragung auf einen MS-Detektor zur massenspektrometrischen Analyse.

HPTLC-Platten haben eine kleinere durchschnittliche Partikelgrösse von Kieselgel, beispielsweise 5 bis 7 Mikrometer, mit einer engeren Verteilung und gleichmässigen Schichtdicke, was die Geschwindigkeit, Effizienz und Sensitivität der Analyse erhöht. Daher ermöglicht die HPTLC nicht nur eine qualitative, sondern auch eine quantitative Expressanalyse verschiedener Proben.[15] Die Schicht besteht normalerweise aus einem hocheffizienten standardisierten Kieselgel, die auf einer Glas- oder Aluminiumplatte (seltener Kunststoff) auf einem Substrat fixiert sind.

Protokolle

Die Wahl der mobilen Phase basiert auf dem als stationäre Phase verwendeten Adsorbensmaterial und den physikalischen und chemischen Eigenschaften des Analyten. Mobile Phasensysteme werden aufgrund ihrer vielfältigen selektiven Eigenschaften verwendet: Diethylether, Methylenchlorid und Chloroform, kombiniert allein oder zusammen mit Hexan als Lösungsmittel zur Festigkeitskontrolle für Normalphasen-DC und Methanol, Acetonitril und Tetrahydrofuran, gemischt mit Wasser, um eine Festigkeitskontrolle bei DC mit Umkehrphase zu erhalten. Die Ionenpaartrennung auf den C-18-Schichten wird unter Verwendung einer mobilen Phase wie Methanol-0,1 M Acetatpuffer (pH 3,5) durchgeführt, der 25 mM Natriumpentansulfonat (15,5: 4,5) enthält.[16]

Die Platten werden nur an der Oberkante festgehalten, um eine Kontamination zu vermeiden. Zur Reproduzierbarkeit und quantitativen Analyse werden die Schichten häufig mit 20 ml Methanol vorgewaschen. Um die Platte zu sterilisieren, kann sie 20 Minuten lang in einem sauberen Trockenofen bei 120°C getrocknet werden.[17] Anschliessend äquilibriert man die Platte mit der Laboratmosphäre (Temperatur, relative Luftfeuchtigkeit) in einem geeigneten Behälter, der vor Staub und Dämpfen geschützt ist.

Sobald die Proben appliziert wurden, sollte das untere Ende der Platte in Wasser getaucht werden. Unter Einwirkung von Kapillarkräften bewegt sich das Entwicklungslösungsmittel anschliessend die Schicht hinauf, bis der substanzspezifische Abstand erreicht ist und die Chromatographie stoppt.[18] .

Das entstandene Chromatogramm wird schliesslich in weissem oder ultraviolettem Licht ausgewertet. Die Möglichkeiten reichen von der visuellen Inspektion elektronischer Bilder bis hin zu quantitativen Bestimmungen mittels Video- oder Scanning-Densitometrie.[19] Die Densitometrie misst reflektiertes Licht.[20] Im Spektralbereich von 190 nm bis 900 nm können Absorptionsspektren aufgezeichnet und Substanzen identifiziert werden

Qualität

HPTLC ist die fortschrittlichste Form der modernen DC. HPTLC-Platten bieten eine verbesserte Auflösung, eine höhere Nachweisempfindlichkeit und eine verbesserte In-situ-Quantifizierung und werden zur densitometrischen Quantifizierung von industriellen Pharmazeutika verwendet.[21] Die Normalphasen-DC-Adsorption an Kieselgel mit einer weniger polaren mobilen Phase wie Chloroform-Methanol wurde für mehr als 90 % der veröffentlichten Analysen von Pharmazeutika und Arzneimitteln verwendet.

Gaschromatographie (GC)

Methode

Die Gaschromatographie (GC) nutzt als Hauptinstrument einen Gaschromatographen. Die Quelle des Trägergases ist meist eine 40-Liter-Flasche mit komprimiertem oder verflüssigtem Gas, die üblicherweise unter hohem Druck steht (bis zu 150 Atmosphären). Am häufigsten wird Helium in der Chromatographie verwendet, seltener Argon und Stickstoff und noch seltener Wasserstoff und andere Gase.

Die Probeneinführungsvorrichtung dient dazu, eine Probe des analysierten Gemisches einer Chromatographiesäule zuzuführen. Eine Chromatographiesäule ist ein Gefäss, dessen Länge wesentlich grösser als sein Durchmesser ist. In jüngster Zeit sind Kapillarsäulen aus Quarzglas mit einer darin abgelagerten stationären Phase am weitesten verbreitet. Die Länge solcher Säulen kann Hunderte oder sogar Tausende von Metern erreichen, obwohl Säulen mit einer Länge von 30 bis 60 Metern häufiger verwendet werden.[22]

Cannabinoide kommen sowohl in neutraler als auch in saurer Form vor. Beim Testen auf den Cannabinoid-Gehalt suchen Benutzer im Allgemeinen nach einem gängigen verfügbaren Cannabinoid. Dieser Gesamtgehalt an Cannabinoiden wird berechnet, indem die Menge an vorhandenem neutralem Cannabinoid mit der Menge an neutralem Cannabinoid kombiniert wird, die durch Decarboxylierung der vorhandenen sauren Version gebildet werden kann.[23]

Protokolle

Bei der Gaschromatographie stellt sich zunächst die Frage der Derivatisierung. Die Notwendigkeit einer Derivatisierung hängt vom Zweck der Analyse ab. Ohne vorläufige Derivatisierung von THC und THCA (das heisst Silylierung) tritt während der GC-Analyse eine Decarboxylierung von THCA auf und die Gesamtmenge an THC in der Cannabisprobe wird bestimmt, indem die Summe der aus THCA gebildeten Volumina an freiem THC und THC gebildet wird.[24] Da das Gesamt-THC die maximale Wirksamkeit von geräuchertem (und daher decarboxyliertem), typischerweise Cannabis, widerspiegelt, wird das Gesamt-THC in den meisten Rechtssystemen als geeigneter Parameter angesehen. Eine vorläufige Derivatisierung ist jedoch erforderlich, wenn die Gehalte für jeden dieser Stoffe festgelegt werden sollen.

200 mg trockene homogenisierte Cannabispflanzenmasse werden in einem Ultraschallbad 15 Minuten lang in 20 ml einer internen Standardlösung extrahiert. Die THC-Konzentration im Cannabisharz ist höher, sodass für die Analyse nur 100 mg Produkt benötigt werden. Zum Testen einer flüssigen Cannabisprobe (Cannabisöl) sind sogar 50 mg des Produkts ausreichend.[25]

Da die Tatsache der quantitativen Decarboxylierung von THCA in einem GC-Liner nicht für alle GC-Systeme bekannt ist, wird dringend empfohlen, die Decarboxylierung vor der GC-Analyse durchzuführen. Dazu werden 500 µl der Lösung in ein 2 ml GC-Röhrchen gegeben. Das Röhrchen wird 12 Minuten lang in einen Heizblock (150°C) gestellt, in dem das Lösungsmittel abgedampft wird und die Decarboxylierung des THCA stattfindet. Der trockene Rückstand wird in 1,5 ml Ethanol gelöst, das Röhrchen wird gut geschüttelt und dann wird die resultierende Lösung durch Gaschromatographie analysiert.[26]

Da sich das Referenzmaterial THC schnell zersetzt und es ziemlich schwierig ist, ein Material von akzeptabler Qualität zu erhalten, wird die quantitative Bestimmung von THC unter Verwendung des Referenzmaterials CBN durchgeführt. Der theoretische Korrelationskoeffizient beträgt 1,00.[27]

Wenn eine separate Analyse von THCA erforderlich ist, das heisst ohne Decarboxylierung gearbeitet wird, wird vor der GC-Analyse eine Derivatisierung von 1,5 ml-Aliquot des Extrakts der angegebenen Substanz (nicht einer thermischen Decarboxylierung unterzogen) durchgeführt. Hierzu werden üblicherweise folgende Reagenzien verwendet: N-Methyl-N-Trimethylsilyltrifluoracetamid und N, O-Bis (trimethylsilyl) Trifluoracetamid/Trimethylchlorsilan (1 Prozent).[28]

Silylierbare Lösungsmittel wie Ethanol werden normalerweise mit einem leichten Stickstoffstrom entfernt. Der Rückstand wird in 1,5 ml Chloroform aufgenommen. Anschliessend werden 100 µl MCTFA zugegeben und 30 Minuten auf 70°C erhitzt.[29] Die resultierende Lösung kann sofort analysiert werden. Referenzspektren der häufigsten Cannabinoidefinden sich in öffentlich zugänglichen kommerziellen Massenspektraldatenbanken.

Anwendungsbeispiele

Mit dieser Methode können gasförmige, flüssige und feste Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 400 g pro Mol analysiert werden, die bestimmte Anforderungen erfüllen müssen, von denen die wichtigsten die Flüchtigkeit, die thermische Stabilität, die Inertheit und die einfache Herstellung sind. Organische Substanzen erfüllen diese Anforderungen in der Regel voll und ganz, daher wird die Gaschromatographie häufig als serielle Methode zur Analyse organischer Verbindungen eingesetzt.[30]

Regularien

Derzeit gibt es nur wenige oder keine Gesetze, die Herstellungspraktiken und Qualitätsstandards für Cannabis-Ausgangsmaterialien regeln. Diese Gesetze unterscheiden sich zudem stark zwischen einzelnen Ländern. Um die Bedenken der Patienten hinsichtlich der Wirksamkeit und Sicherheit von aus Cannabis gewonnenen Therapeutika zu zerstreuen, sind in vielen Ländern Qualitätskontrolltests erforderlich.

Da es derzeit keine zentrale Regulierungsbehörde gibt, die die Qualität von Cannabis kontrolliert, liegt die Verantwortung für die Prüfung beim Hersteller, beim Händler und sogar beim einzelnen Verbraucher – wenn diese ihre eigenen Produkte für den persönlichen medizinischen Gebrauch anbauen.

Da Cannabis derzeit in den USA de facto auf bundesstaatlicher Ebene legalisiert ist, auf Bundesebene jedoch oft illegal ist, kann die konventionelle Drogenregulierung nicht angewendet werden. Das Fehlen dieser Daten bedeutet, dass die FDA keine angemessenen Vorschriften erlassen kann, was darin resultiert, dass die FDA Cannabis für den menschlichen Verzehr für unsicher erklärt.[31] Delta-THC, der psychoaktive Hauptbestandteil der L-Sativa-Pflanze, ist jedoch seit über 25 Jahren von der FDA zugelassen.

Vergleich der Methoden

Die Chromatographie, die alle oben genannten Verfahren umfasst, ist ein physikalisch-chemisches Verfahren zur Trennung und Konzentration, dessen charakteristisches Merkmal die wiederholte Durchführung der Sorptions- und Desorptionsprozesse der in der mobilen Phase enthaltenen Komponenten auf der Oberfläche der stationären Phase ist.[32]

Die moderne Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) ist eine Hochdruckflüssigchromatographie. Unabhängig vom Trennmechanismus ist die mobile Phase bei der HPLC flüssig[33].

Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC) ist eine Fest-Flüssig-Adsorptionschromatographie, bei der das Sorptionsmittel in Form einer Dünnschicht auf einer Platte (Glas, Polymer oder Folie) vorliegt. Als Sorbens wird meist Kieselgel verwendet.[34] Das Prinzip der Methode und die Stufen des HPTLC-Chromatographieprozesses sind identisch mit der klassischen DC. Der Hauptunterschied liegt in der der Standardisierung der Bedingungen und der Automatisierung des chromatographischen Prozesses, was eine maximale Effizienz und Reproduzierbarkeit der Analyse ermöglicht.

Die Gaschromatographie ist ein Verfahren zur Trennung flüchtiger Verbindungen. Die mobile Phase ist hier ein Inertgas (Trägergas), das die stationäre Phase durchläuft. Die mobile Phase kann Wasserstoff, Helium, Argon, Stickstoff sein – diese Trägergase interagieren nicht mit den zu trennenden Substanzen und der stationären Phase.[35] Mit dieser Methode können gasförmige, flüssige oder feste Substanzen analysiert werden, die die Anforderungen der Flüchtigkeit, Inertheit und thermischen Stabilität erfüllen.

Früher war sowohl für den Nachweis von neutralen als auch sauren Versionen HPLC die bevorzugte Methode. Heute kann dies auf dem GC mit einer zusätzlichen Probenvorbereitung erfolgen, um die Probe vor der Analyse zu derviatisieren. Die Derivatisierung verändert die chemische Zusammensetzung des sauren Cannabinoids so, dass es durch die Hitze des GC nicht mehr in eine neutrale Version umgewandelt wird und damit separat nachgewiesen werden kann.[36]

 

[1] vgl. Brunetti, P.; Fabrizio Lo Faro, A.; Pirani, F.; Berretta, P.; Pacifici, R.; Pichini Francesco Paolo Busardò, S. (2020): "Pharmacology and legal status of cannabidiol". Annali dell'Istituto Superiore di Sanità 56 (3). S. 288.

[2] vgl. Clarke, R. C. & Merlin, M. D. (2013). "Cannabis. Evolution and Ethnobotany". University of California Press, Berkeley and Los Angeles. S. 46.

[3] Ebd. S. 61.

[4] vgl. Xiang, Y.; Liu Y.; Lee M.L. (2006). "Ultrahigh pressure liquid chromatography using elevated temperature". Journal of Chromatography A. 1104 (1–2). S. 199.

[5] vgl. Hostettmann, K; Marston, A; Hostettmann, M. (1998). "Preparative Chromatography Techniques Applications in Natural Product Isolation" (Second ed.). Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg. S. 50.

[6] vgl. Gerber, F. et al. (2004). S. 128.

[7] Ebd. S. 128f.

[8] Ebd. S. 129.

[9] vgl. Aced, G.; Möckel, H. J. (1991). "Liquidchromatographie – Apparative, theoretische und methodische Grundlagen der HPLC", VCH, Weinheim. S. 77.

[10] vgl. Henke, H. (1999). "Flüssig-Chromatographie. Analytische und präparative Trennungen". Vogel-Buchverlag, Würzburg. S. 83

[11] Ebd. S. 89.

[12] Ebd. S. 94.

[13] vgl. Aced, G.; Möckel, H. J. (1991). S. 93.

[14] Ebd. S. 23.

[15] Ebd. S. 67.

[16] vgl. Jork, H.; Funk, W.; Fischer, W.; Wimmer, H. (1990). "Thin-Layer Chromatography: Reagents and Detection Methods". Volume 1a, VCH, Weinheim. S. 91.

[17] Ebd. S. 92f.

[18] vgl. Hahn-Deinstorp, E. (2000).. S. 76f.

[19] vgl. Hahn-Deinstorp, E. (2000). S. 82.

[20] Ebd. S. 84.

[21] vgl. Hahn-Deinstorp, E. (2000). S. 38.

[22] Ebd. S. 67.

[23] Ebd. S. 64.

[24] vgl. Fuche, C. et al. (2001). S. 25.

[25] Ebd. S. 26f.

[26] Ebd. S. 27.

[27] Ebd. S. 28f.

[28] Ebd. S. 29.

[29] Ebd. S. 30

[30] vgl. Leibnitz, E.; Struppe, H. G. (Hrsg.) (1984). S. 22.

[31] https://www.fda.gov/news-events/public-health-focus/fda-and-cannabis-research-and-drug-approval-process

[32] vgl. Hostettmann, K. et al. (1998). S. 31.

[33] Ebd. S. 46.

[34] Ebd. S. 48.

[35] Ebd. S. 63.

[36] Ebd. S. 69.

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